抵抗素-ResistinELISA试剂盒

抵抗素-ResistinELISA试剂盒 日期:2020年02月13日03:08来源:T云

样本处理

ELISA待测样本比如血清建议宜在新鲜时检测。如有细菌污染,菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久,其中的可发生聚合,在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来,在5天内测定的血清标本可放置于4℃,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混匀宜轻缓,避免气泡,可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤,澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落,所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测,宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作,也可加入适当防腐剂。

检测步骤

ELISA用血清来检测,首先血液要经过至少半个小时的凝集,然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后,加血清及阴性、阳性对照,还有就是质控品(这是严格的要求,它的范围必须在质控范围内)。经过一个小时的孵育,然后洗板,加底物,半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分,然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。抵抗素-ResistinELISA试剂盒

竞争法(competitiveELISA):样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体,当样品里的自由抗原越多,就可以结合越多的抗体,而固定抗原就只能结合到较少的抗体,反之亦然。经清洗步骤,洗去自由抗原和抗体的复合物,只留下固定抗原和抗体的复合物,拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较,根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量。优势:可适用比较不纯的样本,而且数据再现性很高。缺点:整体的敏感性和专一性都较差。

ELISA新技术——基于细胞法(cell-basedELISA):ELISA新技术——基于细胞法(cell-basedELISA)是一种新型的定性蛋白检测技术,是将细胞直接放在微孔板里培养,待检测时,不需要抽提蛋白和裂解细胞,便可以直接测量微孔板里蛋白经刺激或阻抑作用后的变化差异。优势:更方便,无需裂解细胞,所以目标蛋白损失最少,可测定完整细胞、黏附细胞、还有非粘附细胞;缺点:不能测定抗原量。游离蛋白C-FP-CELISA试剂盒说明

ELISA基本原理

①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。

②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最终结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高,故可极大地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:

①固相的抗原或抗体

②酶标记的抗原或抗体

③酶作用的底物(显色剂)。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

注意事项1

⒈ 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

⒉ 在ELISA中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

⑴ 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

⑵ 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃、18~24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD(opticaldensity-光密度)值。选择OD值比较大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。

双抗体夹心法(sandwichELISA):双抗体夹心法(sandwichELISA)检测是被检测的抗原包被在两个抗体之间,其中一个抗体将抗原固定于固相载体上,即捕捉抗体。另一个则是检测抗体,此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量;或不标记,再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取,才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。优势:高灵敏、高专一性,抗原无须事先纯化;缺点:抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。游离蛋白C-FP-CELISA试剂盒说明

抵抗素-ResistinELISA试剂盒

NEWGEORGE试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被待测指标捕获抗体或抗原的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。

NEWGEORGEBiotech是一家专业从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发及销售生物高新技术企业,研发中心位于弗吉尼亚州里士满生物技术中心,专注于在生物技术领域的前沿技术,致力于提供专业的细胞生物学、分子生物学等相关实验服务和产品研发。主要产品有NEWGEORGEELISA检测试剂盒、放免试剂盒、血液制品、抗体、生物科研试剂、新型实验耗材等,拥有完善的技术服务平台。抵抗素-ResistinELISA试剂盒

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